可康医药

1 已上市药品

1.1   Pembrolizumab

2017年5月23日，默沙东宣布Pembrolizumab获FDA批准用于末线使用治疗带有微卫星不稳定性高（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR）的实体瘤患者。

Pembrolizumab是第一个批准的广谱抗肿瘤药物，自此也揭开了人类广谱抗肿瘤的序幕，“广谱”是指只基于肿瘤驱动基因而不考虑原发部位。。

1.2   larotrectinib

2018年11月27日，FDA加速批准 Bayer 和Loxo Oncology 共同开发的泛癌种靶向药 Vitrakvi（larotrectinib，拉罗替尼）上市，用于治疗携带 NTRK 基因融合的局部晚期或转移性实体瘤的成人和儿童患者。

1.3 Entrectinib

2019年6月18日，瑞士制药巨头罗氏（Roche）控股的日本药企中外制药（Chugai）宣布，日本厚生劳动省（MHLW）已批准Rozlytrek（entrectinib，恩曲替尼）用于治疗神经营养性酪氨酸受体激酶（NTRK）融合阳性的晚期复发性实体瘤的成人和儿童患者。此前，中外制药已在日本提交ROS1/TRK抑制剂entrectinib的2份新药申请（NDA）。其中一份NDA申请批准entrectinib用于神经营养性原肌球蛋白受体激酶（NTRK）融合阳性局部晚期或转移性实体瘤成人及儿科患者，另一份NDA申请批准entrectinib用于转移性、ROS1阳性非小细胞肺癌（NSCLC）患者。

2019年8月19日，FDA批准恩曲替尼(Entrectinib)用于治疗NTRK融合型实体瘤患者，既往治疗后进展的局部晚期或转移性实体瘤患者，无标准治疗方案实体瘤患者的初始治疗，以及ROS1阳性转移性非小细胞肺癌(NSCLC)。

2 NTRK简介

神经营养因子受体酪氨酸激酶基因NTRK1、NTRK2和NTRK3分别编码TRKA、TRKB和TRKC蛋白，它们都是酪氨酸激酶，统称为TRK家族蛋白。神经营养因子及其受体的类型和数量对于维持神经元稳态至关重要。1982年科学家发现了NTRK1，并确定它是个致癌基因。1991年科学家发现TRKA在神经系统中表达，并能被神经生长因子（NGF）诱导而磷酸化。基于这个了解，科学家进一步发现了同家族的TRKB和TRKC。

图1 NTRK发展史

2.1 NTRK基因融合

神经营养因子受体酪氨酸激酶（NTRK)）家族由对神经系统发育和生理至关重要的3个基因组成。这些基因包括NTRK1, NTRK2, and NTRK3，分别编码受体TRKA、TRKB和TRKC。每个受体都被不同的结合因子激活，这种结合因子会触发蛋白质胞内激酶域的磷酸化，触发维持正常神经系统功能的各种信号通路

NTRK基因融合是指NTRK1/2/3基因与其他基因融合，导致TRK蛋白异常，引起癌细胞增殖。NTRK基因融合较为罕见，但在很多难治性肿瘤中都有过发现，包括乳腺癌、胆管癌、结直肠癌、胰腺癌、神经内分泌瘤、腮腺癌、肉瘤、非小细胞肺癌、胃癌、卵巢癌等。

2.1.1 NTRK1

NTRK1在染色体1q21-q22上。该基因在基底前脑的特殊神经元中表达，这些神经元监控记忆过程、疼痛和温度感应。1 NTRK1的编码蛋白TRKA，包含一个细胞间域，由一个近膜区域，TK域和一个短C端尾组成。TRKA是神经生长因子受体（NGFb）。与NGFb结合后，TRKA磷酸化自身和其他MAPK通路蛋白。

2.1.2 NTRK2

NTRK2映射到染色体9q22.1。该基因对TRKB受体进行编码，该受体与脑源性中性粒细胞因子（BDNF）和中性粒细胞因子-4（NTF4）结合。TRKB在前额叶、杏仁核和枕叶表达最高[1.2]。该基因促进神经细胞的可塑性和存活率，以及突触信号传导，甚至可能稳定情绪。TRKB还通过帮助短期突触功能和长期潜能来帮助学习和记忆[5]。

2.1.3 NTRK3

NTRK3映射到染色体15q25。它的编码蛋白TRKC是一种糖蛋白，主要表达于海马、大脑皮层和小脑的颗粒细胞层[6]。NTRK3通过激活MAPK和pi3k/akt通路，介导神经分化和存活。该基因还可以帮助本体感受（通过身体位置感知神经元的分化）和心脏发育（没有TrkC的小鼠几乎总是在出生后的头几周内死于严重的心脏缺陷）[1,2,3,4]

3 NTRK基因融合分布和频率

NTRK合并是高度混杂的；到目前为止，已经发现了超过80种不同的5'融合伙伴，包括下面列出的那些。NTRK1伙伴多见于染色体1，说明染色体内重组是NTRK1融合的主要驱动因素。另一方面，NTRK2和NTRK3融合通常是通过染色体间的重新排列发生的。[5]
 

图2 NTRK1融合

图3 NTRK2融合

图4 NTRK3融合

然而，虽然NTRK1/2/3在很多肿瘤中都可发生融合异常，但其总体阳性率实在太低了，还不够1%。但在部分少见/罕见癌种中其阳性率还是相对较高的，其中大于25%的癌种（甚至可大于90%）有先天性婴儿纤维肉瘤、唾液腺（乳腺样）分泌性癌（MASC）、分泌性乳腺癌；而介于5-25%的癌种为乳头状甲状腺癌、Spitz痣、先天性中胚层肾瘤、乳头状甲状腺癌（放疗照射后）、桥脑胶质瘤（Pontine glioma）。而发病率大的肿瘤中其阳性率甚至还低于1%（如肺癌、结直肠癌）。

所有肿瘤类型的总发病率约为：0.21%（对11,116患者的统计）。

图5肿瘤中的发生率

表1 NTRK基因融合在成人和儿童肿瘤中的分布和频率

4 检测

4.1 检测方法

NTRK融合可以使用几种不同的技术来检测。基因融合现在通常在诊断后不久进行筛选，以确定是否可以将NTRK特异性治疗纳入治疗方案。临床医生可以使用以下一种或几种测试方法的来检测NTRK融合。

4.1.1 Fluorescent in situ Hybridization (FISH)

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种重要的非放射性原位杂交技术，出现于20世纪70年代末的遗传学实验技术。它根据碱基互补配对原则，通过特殊手段使带有荧光物质的探针与目标DNA接合，最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置。[7]

荧光原位杂交技术的基本原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性—退火—复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析 [8]  。

4.1.2 Immunohistochemistry

利用免疫组织化学方法鉴定含有特定基因融合的肿瘤，其前提是染色体重组导致肿瘤细胞融合基因表达上调。关于识别TRK融合有关的癌症患者，最近出版的研究显示，当还没有接受常规的分子基因组分析，并且肿瘤中NTRK基因融合的发生率较低时，免疫组化可以以此作为选择患者进行后续分子检测的一种方式。

4.1.3 Next Generation Sequencing (NGS)

NGS同时对数以百万计的小DNA或RNA片段进行测序，它是通过生物信息学分析将这些片段映射到人类参考基因组中。基于DNA和RNA的NGS都可用于检测NTRK的融合，但基于RNA的NGS更可取，因为它只检测框架内的、转录的基因融合，而不测序NTRK融合产生的大型电子区域。

4.1.4 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

RT-PCR定量RNA表达。它是目前是检测和测量信使RNA最灵敏的方法。该技术利用逆转录酶从mRNA转录本中生成互补的DNA (cDNA)，然后用PCR扩增感兴趣的区域。

4.2 检测流程

ESMO建议NTRK检测[9]。
 

图6 ESMO建议NTRK检测流程

4.3耐药突变

在检测NTRK融合突变的时候，还需要检测耐药的位点。比如:TRKA出现G595R突变,TRKB出现 G639R 突变或者TRKC出现G623R突变等,一旦出现耐药,可以考虑使用针对这些耐药突变的二代NTRK抑制剂。

图7耐药突变

5检测试剂盒

基于组织学的NGS检测方法：一些商业上可用的多基因 panel 可以检测NTRK融合 [10]。
 

图8 检测试剂盒

6 NTRK抑制剂临床研究情况汇总

表2 TRK抑制剂临床研究情况汇总

参考文献
1. Amatu A, et al. (2016) ESMO open 1.2: e000023.
2. Raez LE, et al. (2016) Future Medicine: 5.1: 1-4.
3. NIH.gov
4. UniProt.org
5. Mertens F, et al. (2015). Nat Rev Cancer 15.6: 371–381.
6. Genecards.org

7荧光原位杂交技术的应用进展．万方．2014-10-23

8荧光原位杂交技术的研究进展 ．万方．2014-06-08

9 Figure adapted from Marchio C. et al , 2019.

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